Cos'è molecular beacons?

I molecular beacon (letteralmente "fari molecolari") sono oligonucleotidi a singolo filamento conformati a forcina (hairpin) progettati per rilevare la presenza di una specifica sequenza di acido nucleico in una soluzione. La struttura a forcina porta un fluoroforo a un'estremità e un quencher all'altra estremità.

In assenza della sequenza bersaglio, la struttura a forcina mantiene il fluoroforo e il quencher in prossimità fisica, causando un'estinzione della fluorescenza tramite trasferimento di energia per risonanza di Förster (https://it.wikiwhat.page/kavramlar/trasferimento%20di%20energia%20per%20risonanza%20di%20Förster). Quando il molecular beacon si ibrida con la sequenza bersaglio complementare, la forcina si apre, separando il fluoroforo dal quencher e ripristinando la fluorescenza. Questa variazione di fluorescenza segnala la presenza della sequenza bersaglio.

Le caratteristiche principali dei molecular beacons sono:

• Struttura a forcina: Essenziale per la loro funzione, con un anello contenente la sequenza complementare al bersaglio e uno stelo che mantiene il fluoroforo e il quencher vicini in assenza del bersaglio.
• Fluoroforo e quencher: Localizzati alle estremità del molecular beacon, la loro vicinanza (e successiva separazione) è cruciale per il meccanismo di rilevamento.
• Specificità: La sequenza dell'ansa del molecular beacon è progettata per essere altamente specifica per la sequenza bersaglio desiderata, minimizzando il rischio di ibridazione non specifica.
• Rilevamento in tempo reale: La variazione di fluorescenza può essere monitorata in tempo reale, permettendo analisi quantitative.

I molecular beacons trovano applicazione in diverse aree, tra cui:

• Real-time PCR (qPCR): Per il rilevamento e la quantificazione di specifici trascritti genici.
• Ibridazione in situ (FISH): Per localizzare sequenze specifiche di DNA o RNA all'interno di cellule o tessuti.
• Saggi di allele-specific PCR: Per discriminare tra diverse varianti alleliche di un gene.
• Diagnostica di malattie: Per il rilevamento di agenti patogeni o biomarcatori specifici.

L'efficacia dei molecular beacons dipende da fattori come:

• Design: La sequenza, la lunghezza dello stelo e la stabilità della forcina devono essere ottimizzate per garantire la specificità e l'efficienza dell'ibridazione.
• Condizioni di reazione: La temperatura, la concentrazione di sali e la presenza di altri componenti possono influenzare l'ibridazione e la fluorescenza.
• Quenching: L'efficienza del quenching è fondamentale per minimizzare il segnale di fondo e massimizzare il rapporto segnale/rumore.

In sintesi, i molecular beacons sono strumenti versatili e potenti per il rilevamento specifico di sequenze di acidi nucleici, con applicazioni in una vasta gamma di aree della biologia molecolare e della diagnostica.